Sanger DNA sequencing


Publicatie datum:

Wat is Sanger DNA sequencing en hoe werkt het?

Gesponsorde koppelingen

Een erg belangrijke techniek in de moleculaire biologie is het sequencen. Sanger sequencing is vanaf 1980 voor de meeste laboratoria een standaard methode geworden. Sanger sequencing word ook wel dideoxy sequencing genoemd, door het gebruik van dideoxynucleotiden. In vergelijking tot normale nucleotiden, bevatten dideoxynucleotiden een waterstofgroep op de 3' koolstof. Op deze plaats zit normaal gesproken een hydroxylgroep. Maar hoe zit het dan verder met Sanger sequencing? Dit lees je in dit artikel. Naast Sanger sequencing bestaat er ook pyrosequencing en tegenwoordig ook Next Generation Sequencing (NGS). Deze technieken produceren meer en sneller data dan Sanger sequencing. Met NGS kan je zelfs in één keer bijvoorbeeld het hele exome of transcriptoom van een organisme bepalen.  Op deze laatste twee sequencemethode gaan we in dit artikel niet in, vanwege de complexiteit.

Wat is Sanger DNA sequencing?
Door middel van sequencing kan de primaire structuur van DNA bepaald worden, dus de volgorde van de basen. Deze veel gebruikte sequence methode maakt gebruik van de "chain termination method". Deze methode is ontwikkeld door Frederick Sanger en wordt daarom ook Sanger sequencing genoemd. De chain termination methode gebruikt specifieke terminatie (beëindiging) van een DNA synthese reactie.

Voorafgaand aan Sanger sequencing wordt een PCR uitgevoerd en met één van de primers kan één sequence reactie uitgevoerd worden. Zie http://artikelen.foobie.nl/verslagen-scripties/polymerase-chain-reaction-pcr/ voor verdere informatie over DNA en PCR. Het enzym DNA polymerase zorgt ervoor dat de primer verlengd wordt. Dit enzym repliceert DNA. Voordat het DNA gesequenced kan worden, moet het DNA eerst worden gedenatureerd. Daarna wordt de primer vastgehecht aan de template. Deze primer is speciaal ontworpen zodat het 3' uiteinde naast het DNA ligt waar je interesse in hebt. Deze primer moet worden gelabeld. Dit kan zowel radioactief als fluorescent. Tegenwoordig wordt er meer met fluorescente labeld gewerkt. De oplossing wordt verdeeld in vier buisjes, met de labels "G", "A", "T" en "C".

Hierbij moeten ook de vier dideoxynucleotiden toegevoegd worden. De dideoxynucleotiden zijn aanwezig met ongeveer een honderdste van de concentratie van de normale voorlopers. De dideoxynucleotiden verhinderen toevoeging van nog meer nucleotiden. Dit gebeurd doordat een fosfodiester binding niet gevormd kan worden tussen de dideoxynucleotide en het volgend komende nucleotide. Omdat het DNA wordt gesynthetiseerd, worden nucleotiden toegevoegd aan de groeiende keten van het DNA-polymerase. Af en toe wordt er een dideoxynucleotide opgenomen in de keten in plaats van een normaal nucleotide. Hierdoor wordt dus de DNA ketting beëindigd.

Banden van allrlei verschillende lengtes worden geproduceerd. Wanneer de reacties compleet zijn, wordt het DNA opnieuw gedenatureerd, voorafgaande aan de elektroforese. De vier buizen worden in een aparte laan op de polyacrylmide gel geladen, om zo de verschillende lengtebanden te kunnen onderscheiden van elkaar. Naast het gebruik van een polyacrylmide gel, kan er ook gebruik worden gemaakt van een capillair. De is gevuld met een viskeuze polymeer. Tegenwoordig wordt deze laatste methode het meest gebruikt.

"Dye Terminator Sequencing"
In plaats van de primers te labelen, kunnen ook de terminatoren gelabeld worden. Dit wordt ook wel "Dye Terminator Sequencing" genoemd. Hierdoor kan een hele set in één reactie uitgevoerd worden. Dit in tegenstelling tot de methode die primer-labeling gebruikt en er vier reactie's nodig zijn. Iedere ketting-terminator kan gelabeld worden met een andere fluorescerende kleurstof. Deze methode wordt het meeste gebruikt, omdat het sneller en goedkoper is. Zoals in de inleiding vermeld, zijn er nu recenter ontworpen sequence technieken op de markt gebracht, die nog sneller en nog effeciënter (hierdoor ook goedkoper) zijn.


Foobie gebruiker MelSch

Auteursinformatie


Geschreven artikelen: 5
Leden aangebracht: 0

Meer uit de categorie verslagen-scripties

Wie was Giacomo Casanova?

een uitgebreid verslag over de historische figuur Giacomo Casanova en zijn leven.

Waarom Turkije niet mag toetreden als lid van de EU!

Gaan EU en Turkije samen? Turkije mag onder geen voorwaarde toetreden tot de EU

Lokauto

Is het plaatsen van een lokauto onrechtmatig

Historisch overzicht en ontwikkelingen van het Europees recht

Een kort Historisch overzicht en ontwikkelingen van het Europees recht van de afgelopen 50 jaar

Ontstaan monarchie in Nederland

Geschiedenis van de Nederlandse monarchie

Diagnostiek van cognitieve functies

cognitieve functies kort omschreven met de daarbij behorende tests

Van traditionele naar moderne opvoeding.

Aan de hand van de boeken van LeVine en Stearns wordt de verandering van traditionele naar moderne opvoeding beschreven en verklaard.

De rol van Berlijn in de koude oorlog

Uitleg over de rol van Berlijn in de koude oorlog

Wir haben es nicht gewusst

Betoog over het onethisch handelen van de kerk na het aan het licht komen van verschillende zedenmisdrijven

Literatuur

verslag over litratuur

Ischa Meijer - De Interviewer

Leesverslag van het boek De Interviewer, van Ischa Meijer

Volkenrecht - De bouw van de muur door Israel op bezet Palestijns gebied

De bouw van de muur door Israel op bezet Palestijns gebied, is dit gerechtvaardigd of niet?

Het Verdrag van Tordesillas

Korte uitleg waarom men in Brazilie Portugees spreekt en in de rest van Latijns Amerika Spaans.

Volkenrecht - Actuele situatie in Libië

Actuele situatie in Libië

Uruzgan, een succes of niet?

Is het invallen van Afghanistan wel verstandig geweest. En had Nederland nou wel mee moeten doen? En wat hebben we nu eigenlijk bereikt in Uruzgan? Wat zijn precies de feiten? Dit zijn vragen die ik allemaal ga beantwoorden in mijn paper.

Mensen Overtuigen & Beïnvloeden: De 'Door in the Face' techniek

Mensen overtuigen van iets dat ze eigenlijk niet willen doen: Klinkt ingewikkeld, maar door deze methode wordt het een stuk makkelijker.

De intrinsiek sociale groep

Dit artikel is een samenvatting van het stuk over de intrinstiek sociale groep uit het boek cultuur en lichaam van Voestermans en Verheggen

Welke elementen zijn kenmerkend in de poëzie van M. Vasalis?

De kenmerken in de poezie van M. Vasalis die haar gedichten zo gevoelig en mooi maken.

Weitz filosofische opvattingen

korte omschrijving van de filosofie van Weitz

Genoeg van de economie

Heeft nederland genoeg van de economie?

Volkenrecht; de onafhankelijkheidsverklaring van Kosovo

De onafhankelijkheidsverklaring van Kosovo

Ontwikkelingshulp moet stoppen

Ontwikkelingshulp geven we aan derde wereld landen opdat zij ook kans hebben om te groeien en een welvarend land te worden.

Sanger DNA sequencing

Wat is Sanger DNA sequencing en hoe werkt het?

Aristoteles meets Tarantino: Inglorious Basterds

Een onderzoek naar Tarantino’s ‘Inglorious Basterds’ aan de hand van begrippen over de eenheid van plaats tijd en handeling van Aristoteles.

De filosofie van Wittgenstein

Een korte beschrijving van de filosofie van Wittgenstein