Polymerase Chain Reaction (PCR)


Publicatie datum:

Wat is een Polymerase Chain Reaction (PCR)?

Gesponsorde koppelingen

Misschien heb je er nog nooit van gehoord, of misschien heb je alleen wat informatie nodig voor het inzetten van je eigen Polymerase Chain Reaction (PCR) in het laboratorium. In dit artikel staat uitgelegd wat deze reactie inhoud en een aantal tips om deze uit te voeren. Biochemicus K. Mullis heeft als eerste PCR uitgevoerd als test en won hiermee in 1933 de Nobelprijs. Tegenwoordig is de techniek niet meer weg te denken in laboratoria waar moleculaire biologie een rol speelt. Een zeer belangrijke en veel gebruikte techniek dus!

Gesponsorde koppelingen

Wat is een PCR?
PCR staat voor Polyperase Chain Reaction, in het Nederlands: Polymerase Ketting Reactie. Het is een techniek dat gebruikt wordt voor de amplificatie van DNA. Dit betekent dat je een zeer kleine hoeveelheid DNA specifiek kan vermeerderen, totdat er zoveel product (amplicon) is ontstaat dat het genoeg is om dit te analyseren. Onder een kleine hoeveelheid kan je een aantal moleculen verstaan.

Wat is DNA?
DNA (deoxyribonucleïnezuur) is een drager van de erfelijke informatie in allerlei organismen. Je DNA (desoxyribonucleïnezuur) bestaat uit een dubbelstrengse helix. Het DNA is opgebouwd uit vier verschillende nucleotiden: adenine (A), thymine (T), guanine (G) en cytosine (C). Adenine vormt een basenpaar (bp) mer thymine. Guanine vormt een basenpaar met cytosine. Het menselijke genoom heeft ongeveer 3,2*109 bp. Drie nucleotiden achtereenvolgens kunnen een codon vormen en coderen voor een aminozuur. Een gen codeert voor een eiwit. Het menselijke genoom bestaat uit ongeveer 30.000 genenparen. Een eiwit bestaat uit een sequentie van aminozuren. Een startcodon (ATG) en een stopcodon (TAG, TAA of TGA) geven het begin en het eind aan van het eerste en laatste aminozuur van een eiwit.

Voordat er uberhaubt een PCR uitgevoerd kan worden, moet het DNA eerst uit een cel (bacteriën, dierlijke cellen, etc.) of uit een heel stuk weefsel worden geïsoleerd. Dit kan bijvoorbeeld plantaardig weefsel zijn (een blad van een plant), dierlijk weefsel (epitheel weefsel),  of zelfs tumorweefsel.

Hoe gaat een PCR in zijn werking?
Na isolatie van het DNA kan er een PCR uitgevoerd worden om een specifiek deel van het DNA te amplificeren. Eerst moeten er specifieke primers (sense en antisense) ontworpen worden, die het specifieke target DNA deel flankeren. Dit specifieke deel wordt herkent door een enzym (polymerase). De primers bestaan uit een omgekeerde sequentie van het DNA waaraan het moet binden. Ze zijn meestal tussen de 20 en 40 basen lang.

De PCR-reactie is onderverdeeld in drie delen, namelijk:

1. Denaturatie (90 - 96°C)
2. Annealing (50 - 68°C)
3. Extentie (72°C)

Tijdens denaturatie wordt de temperatuur verhoogd zodat de dubbelstrengse DNA helix uitsmelt tot enkelstrengs DNA. Door de hoge temperatuur worden de waterstofburggen tussen de ketens verbroken. De covalente bindingen blijven in stant. Tussen de denaturatie en de annealing mag niet te veel tijd zitten, omdat het DNA anders de kans kan krijgen om weer een dubbele helix te vormen. Tijdens de annealing krijgt het DNA de kans om de specifiek ontworpen primers te binden (hybridiseren). Bij de extentie zorgt het enzym DNA-polymerase ervoor dat de ketens worden verlengd vanaf de primers in de 3'-->5' richting. De primers dienen hier als startpunt en worden herkent door het DNA polymerase. Hierdoor wordt het enkelstrengse DNA dubbelstrengs. Polymerase heeft hiervoor wel nucleotiden nodig die ingebouwd moeten worden. Het enzym bouwt één voor één een nucleotide in en bindt deze vervolgens ook aan elkaar.

Berekening
Eén PCR cycle (1 keer bovengenoemde stap 1 t/m 3) geeft een verdubbeling van het DNA. Er is dus één kopie gevormd en wordt een amplicon genoemd. Bij de volgende cycle wordt opnieuw het DNA gedenatureerd, primers gebonden en verlengt. De formule van de hoeveelheid gevormd amplicon is 2n. In deze formule is n het aantal cycli. Er is dus een exponentiële toename van het product. Deze toename gaat niet oneindig door, doordat de efficiëntie van de reactie afneemt na enige tijd.

Detectie
Tijdens de PCR wordt er dus een bepaalde hoeveelheid product gevormd. Na de PCR wil je controleren of de PCR is gelukt en of er wel product is gevormd. Dit kan je doen door middel van een gelelektroforese. Gelektroforese is een scheidingstechniek. Door een elektrisch veld worden moleculen bewogen door de gel. DNA is negatief geladen en zal dus naar de positief geladen pool migreren. Grotere moleculen zullen langzamer door de gel migreren dan kleine moleculen. Zo kan er onderscheidt gemaakt worden van het PCR product en eventueel gevormde primerdimers. PCR producten zijn meestal tussen de 100 en 400 bp. Primerdimers daarentegen zijn kleiner, rond de 50 bp. Het zijn bijproducten van een PCR en bestaan uit primermoleculen die aan elkaar zijn gehybridiseerd. Dit komt door stukjes complementaire basen in de primers. Het probleem van de vorming van primerdimers kan je verminderen door een lagere concentratie primers te gebruiken in de PCR reactie.

Real-time PCR
Naast het gebruik van een PCR om het DNA te vermeerderen om te kunnen analyseren, kan er ook een real-time PCR uitgevoerd worden. Een real-time PCR wordt ook wel een quantitative PCR (qPCR) genoemd. Dit komt doordat deze techniek wordt gebruikt om zowel detectie als kwantificatie mogelijk te maken. Hier kan tijdens de PCR de amplificatie al worden aangetoond. Dit kan door flurorescent gelabelde probes aan de reactie toe te voegen, die binden aan het deel van het DNA waarin je geinteresseerd bent. Tijdens de reactie wordt de probe afgebroken en wordt het fluorescente label zichtbaar en gaat licht uitzenden van een bepaalde golflengte. Dit licht kan gemeten worden door een real-time PCR apparaat. Hoe meer product er gevormd wordt, hoe sterker het signaal.

Het signaal wordt vaak uitgedrukt in een relatief fluorescentie eenheid (RFU). Deze wordt uitgezet tegen het aantal cycli van de PCR. De tresholdcyclus (Cq-waarde) is het aantal cycli waarbij het signaal boven een bepaalde detectiegrens komt. Door middel van deze grafiek kan de hoeveelheid DNA berekend worden. 


Foobie gebruiker MelSch

Auteursinformatie


Geschreven artikelen: 5
Leden aangebracht: 0

Meer uit de categorie verslagen-scripties

Wie was Giacomo Casanova?

een uitgebreid verslag over de historische figuur Giacomo Casanova en zijn leven.

Het Verdrag van Tordesillas

Korte uitleg waarom men in Brazilie Portugees spreekt en in de rest van Latijns Amerika Spaans.

Akra en Dyodyo

Akra en Dyodyo zijn Geestelijke leiders van de Mens.

Kwantitatieve Observaties

Een korte uitleg over kwantitatieve observatie

Analyse Herfstlied

Analyse Herfstlied